מה זה ספקטרופוטומטריה
ספקטרופוטומטריה היא שיטה למדידה של כמות האור הנספגת על ידי חומר כימי , זאת על ידי השוואת עוצמת האור המוקרנת אל תמיסת הדגימה מול עוצמת האור היוצאת מתמיסת הדגימה.
העיקרון הוא שכל תרכובת קולטת או מעבירה אור בטווח אורך גל מסוים. מדידה זו יכולה לשמש גם למדידת ריכוז חומר הכימי ידוע.
ספקטרופוטומטריה היא אחת השיטות היעילות ביותר לניתוח כמותי בתחומים שונים כמו כימיה, פיזיקה, ביוכימיה, הנדסת חומרים וכימיה ויישומים קליניים.
מבוא
כל תרכובת כימית קולטת, מעבירה או מחזירה אור (קרינה אלקטרומגנטית) על פני טווח אורך גל מסוים. ספקטרופוטומטריה מודדת כמה מהתמיסה הכימית כימי סופגת או מעבירה. ספקטרופוטומטריה משמשת באופן נרחב לניתוח כמותי בתחומים שונים (למשל כימיה, פיזיקה, ביולוגיה, ביוכימיה, הנדסת חומרים וכימיה, יישומים קליניים, יישומים תעשייתיים וכו '). כל יישום העוסק בחומרים כימיים יכול להשתמש בטכניקה זו.
בביוכימיה, למשל, משתמשים בו לקביעת תגובות מזרזות אנזים. ביישומים קליניים, הוא משמש לבדיקת דם או רקמות לצורך אבחון קליני.
ספקטרופוטומטר הוא מכשיר המודד את כמות הפוטונים (עוצמת האור) הנספגת לאחר שהוא עובר דרך תמיסת הדגימה. בעזרת הספקטרופוטומטר ניתן לקבוע את כמות החומר הכימי הידוע (ריכוזים) על ידי מדידת עוצמת האור שעובר דרך תמיסת הדגימה.
.בהתאם לטווח אורך הגל של מקור האור, ניתן לסווג אותו לשני סוגים שונים:
- ספקטרופוטומטר גלוי : משתמש באור בטווח האולטרה סגול UV (185 - 400 ננומטר) ובטווח הנראה (400 - 700 ננומטר) של ספקטרום הקרינה האלקטרומגנטית – אילו הם מרבית הספקטרופוטומטרים.
- ספקטרופוטומטר- IR : משתמש באור בטווח האינפרא אדום (700 - 15000 ננומטר) של ספקטרום הקרינה האלקטרומגנטית.
בספקטרופוטומטריה גלויה ניתן לקבוע את ספיגתו או העברתו של חומר מסוים על ידי הצבע הנצפה.
לדוגמא, דגימת תמיסה הקולטת אור בכל הטווחים הגלויים (כלומר, אינה משדרת אף אחד מאורכי הגל הגלויים) נראית שחורה בתיאוריה.
מצד שני, אם כל אורכי הגל הגלויים מועברים (כלומר לא סופגים דבר), דגימת התמיסה נראית לבנה.
אם דגימה סופגת אור אדום (~ 700 ננומטר), היא נראית ירוקה מכיוון שירוק הוא הצבע המשלים של אדום.
בספקטרופוטומטרים גלויים, בפועל, משתמשים בפריזמה אופטית (מנסרה אופטית) כדי לצמצם טווח מסוים של אורך גל (לסינון אורכי גל אחרים) כך שרק קרן האור באורך גל רצוי המסוימת עוברת דרך דגימת פתרון.
תמונה ל ספקטרופוטומטר מבית MRC:
מבנה בסיסי של ספקטרופוטומטר:
האיור הבא ממחיש את המבנה הבסיסי של ספקטרופוטומטר. הוא מורכב ממקור אור, קולימטור, מונוכרומטור (פריזמה), בורר אורכי גל, קיווטה לתכולת הדגימה, גלאי פוטואלקטרי, ותצוגה דיגיטלית .
ממקור האור יוצאת אלומת אור אל פריזמה (מנסרה), המפרקת את האור הלבן ומפרידה בין אורכי הגל השונים.
על ידי סיבוב הפריזמה אפשר להביא את קרן האור בעלת אורך הגל הרצוי אל מול הסדק, דרכו עובר האור אל הדגימה.
באמצעות הנתונים המתקבלים מהמדידה, ניתן לקבל מידע על אופי החומר שבדגימה וכן על ריכוזו בדגימה (תמיסה).
ספקטרופוטומטר, באופן כללי, מורכב משני חלקים עיקריים: ; ספקטרומטר ופוטומטר.
ספקטרומטר הוא מכשיר המייצר, בדרך כלל מפזר ומודד אור.
פוטומטר מציין את הגלאי הפוטואלקטרי המודד את עוצמת האור.
• ספקטרומטר : מייצר טווח אורך גל של אור. שעובר דרך עדשה שמרכזת את הקרן. קרן האור עוברת דרך מונוכרומטור (פריזמה אופטית) שמפצלת אותה למספר אורכי גל בספקטרום האור. בורר אורכי הגל (חריץ) מעביר רק את אורכי הגל הרצויים.
• פוטומטר (גלאי האור) : לאחר שטווח האורך הגל הרצוי של האור עובר דרך תמיסת הדגימה בקיווטה , הפוטומטר מזהה את כמות הפוטונים הנספגת ושולח אות לתצוגה דיגיטלית
מבדילים בין ספקטרופוטומטר עם קרן יחידה וקרן כפולה .
במכשיר קרן יחידה אלומת האור עוברת מהפריזמה דרך תא דגימה ופוגעת בגלאי האור.
במכשיר קרן כפולה אלומת האור היוצאת מהפריזמה מפוצלת בעזרת מראות לשתי אלומות ולכל אחת מהן דרך אופטית אחרת. אלומה אחת מגיעה לגלאי האור דרך תמיסת ייחוס . האלומה השנייה מגיעה לגלאי האור דרך הדגימה .
היתרון של ספקטרופוטומטר קרן כפולה שבסריקה אחת מקבלים ספקטרום לעומת מכשיר עם קרן אחת צריך שתי סריקות על מנת לקבל את אותה תוצאה.
על ידי הספקטרופוטומטר ניתן לייצר מגוון רב של אורכי גל.
תרכובות שונות סופגות בצורה הטובה ביותר אורכי גל שונים של אור - כך ניתן לזהות תרכובות שונות.
לדוגמא, ל- p-nitrophenol (תמיסה חומצית) יש את הספיגה המרבית בכ -320 ננומטר ו- p-nitrophenolate (תמיסה בסיסית) לספוג בצורה הטובה ביותר ב- 400 ננומטר, כפי שמוצג באיור הבא:
חישובי הריכוזים באמצעות התוצאות מתבססים על חוק באר-למברט.
חוק באר-למברט , המכונה גם חוק באר, קובע כי קיים קשר לינארי בין הספיגה לריכוז הדגימה.
Io היא עוצמת האור הפוגע בדוגמא באורך גל מסוים.
It היא עוצמת האור היוצא מן הדוגמא באותו אורך גל .
A נקראת הבליעה (absorbance) ונמצאת ביחס ישר לריכוז הדוגמא ולעובי שלה.
בדרך כלל נוהגים לציין את אחוז ההעברה ,כלומר הנוסחה היא: (It/ Io) * 100
אם מבקשים את תוצאת הבליעה של הדגימה (סימון A , מינוס לוג שבר של האור העובר) , אז הנוסחה היא: A=-log(It/Io)